El trabajo más relevante del estadounidense fue la creación de Spider-Man, al que puso su traje lanzatelarañas y sus colores (azul y rojo) distintivos, después de que Lee rechazara los bocetos de Jack Kirby, creador de Thor. El famoso personaje diseñado por Ditko debutó en 1962 y, gracias a la popularidad que adquirió, pasó a protagonizar su propia serie en 1963 con The Amazing Spider-Man.
Otro de los grandes logros del artista fue el diseño de Doctor Extraño. El doctor Stephen Vicent Strange apareció por primera vez en 1963, al mismo tiempo que Spider-Man. Sin embargo, a mediados de la década de los 60 decidió abandonar Marvel por diferencias irreconciliables con Lee.
Poco después, Ditko acabó en DC Comics, rival de Marvel. En dicha compañía dio vida al villano de Batman, The Creeper, el cual tuvo un papel muy secundario. En DC no gozó de la relevancia de Marvel debido a las cuestiones éticas que planteaban sus personajes, las cuales no terminaron de convencer al público.
Tanto Marvel como DC Comics han querido dedicar unas palabras al artista a través de las redes sociales. En el caso de la primera compañía han asegurado que "Steve transformó la industria y el Universo Mavel", además de adjuntar una foto del primer número de The Amazing Spider-Man.
En cuanto a DC Comics dedicaron un emotivo mensaje acompañado de una imagen de Halcón y la Paloma, creados por Ditko: "Steve Ditko fue uno de los creadores más increíbles en la historia de los cómics, y nos demostró que hay un héroe en todos nosotros".